Разработка сайта для Вашего бизнеса. Веб дизайн. Дизайн логотипа, фирменного стиля, рекламная фотография . Комплексный рекламный креатив.

Ralex. We do the work.
На рынке с 1999го года. Средняя ценовая категория. Ориентация на эффективность решений.
Ознакомтесь с нашим портфолио
Узнайте больше о услугах
Свяжитесь с нами:
E-mail: [email protected]
Tel: (044) 587 - 84 - 78
Custom web design & дизайн и разработка сайта "под ключ"
Креативный, эффективный дизайн. Система управления сайтом (СУС).
Custom flexible разработка систем электронной коммерции
Система e-commerce разрабатывается под индивидуальные потребности. Гибкая функциональность.
Search Engine Optimzation & оптимизация под поисковые системы (SEO)
Постоянная оптимизация и мониторинг сайта в поисковых системах. Достигаем результата быстро и эффективно
Custom logo design & дизайн логотипа и фирменного стиля
Многолетний опыт. Огромное портфолио. Уникальное предложение и цена.
профессиональная рекламная фотография
креативно, смело, качественно
Custom logo design & рекламный креатив. дизайн рекламы
Многолетний опыт. Огромное портфолио. Уникальное предложение и цена.

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector | Protocol (Translated to Russian)

  1. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector За допомогою...
  2. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

За допомогою системи BIBAC-GW, репортер конструкції для вивчення ODM в рослинах були созданние10. Конструкції були розроблені в pENTR-gm вектора входу шлюза12 і вставляється в pBIBAC бар-GW (рис. 1) з використанням реакції рекомбінації шлюзу LR.

Арабідопсис були перетворені з pDM19, BIBAC-бар-GW плазмида з mTurquoise-eYFP репортер, що перевозять кодоном трансляционная стоп рамка eYFP читання в позиції 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (Малюнок 2) 10. В цілому 126 рослини арабідопсис були перетворюється (9 рослини в горщик, 14 горщики). Насіння цих рослин були об'єднані, посіяли на піддони з грунтом і дозволено рости за два тижні до початку лікування розчином глюфосинату амонію. Тільки саджанці, висловлюючи бар Джин (присутній в BIBAC-бар-GW) вижити глюфосинату амонію лікування (рис. 3). В цілому були визначені 11 мутація перетворена з pDM19, відповідно перетворенню ефективності 0,02% насіння проаналізовані.

Для 11 мутація ізольовані ДНК промокальним був використаний для визначення кількості Т-ДНК інтеграцій. Для цієї мети геномної ДНК був скорочений з Bgl II або Sca я (стратегія розроблена на малюнку 4A). Обидва цих ензимів обмеження тільки один раз розрізати на T-ДНК послідовності (рис. 7A). Гібридизації з зондами, визнаючи бар і eYFP, що кодують області допускається визначення числа відповідних фрагментів ДНК.

Кількість окремих ДНК фрагментів на помарки, допускається для оцінки кількості вставок T-ДНК в лінії репортер (Таблиця 1). Один гібридизувати фрагментів з бару і eYFP зонда вказано наявність єдиного інтеграції T-ДНК. Від 11 мутація проаналізовані шість здійснюється однією інтеграцій. Середня кількість впроваджень був 1.2.

Для 6 ліній, що перевозять один інтеграції T-ДНК цілісність конструкції вставленої репортер був випробуваний з використанням ДНК промокальним (стратегія розроблена на малюнку 4В). Геномна ДНК був скорочений з Bgl II і Pci я випустити 5,5 КБ фрагмент, що містить Джин фьюжн бар і mTurquoise-eYFP (рис. 7A). Зонд проти eYFP був використаний для визначення очікуваного фрагмент. Всі заводи випробування перевозяться фрагмент недоторканими. Зверніть увагу, що фрагмент вивчені виключає зліва і право T-ДНК кордону і тому не перевіряє цілісність всього T-ДНК, але тільки частина, яка містить трансгенів інтерес.

Експресії гена флуоресцентні репортер був визначений в незалежних поштучно трансгенних ліній тільки відрізняються геномної розташування T-ДНК. Відносне стенограми рівні репортер ініціативи промоутер mTurquoise-eYFP CaMV 35S були виміряні за RT-ПЛР в чотири лінії репортер DM19, що перевозять недоторканими, однієї копії інтеграцій, з яких геномні позиція була определени10. Зміни в рівнях вираження гена репортера між лініями був незначним: максимальна різниця в рівнях РНК mTurquoise-eYFP був в 2 рази (рис. 8A).

Далі в ці лінії репортер була проведена ODM. Три з чотирьох ліній незалежним репортером показали досить аналогічні ODM ефективності (Малюнок 8B). Однак, одна лінія, DM19 [4] 1, принесли досить низька ефективність ODM, в порівнянні з іншими лініями. Ці результати показують, що ODM залежить від місцевих геномної контексту. Яким чином місцеві геномної контексті інтеграції T-ДНК в DM19 [4] 1 відрізняється від інших ліній належить визначити. Аналіз доступних наборів знаків активних і неактивних хроматину в геномної місцях інтеграції T-ДНК в НЕ трансгенних рослин не представила ответ10.

Малюнок 1: функціональні карти pBIBAC-GW векторів
Малюнок 1: функціональні карти pBIBAC-GW векторів. pBIBAC-GW похідні доступні або опір до глюфосинату (бар) або DsRed флуоресценції в насіння пальто (DsRed) як маркер виділення в рослинах. Для обох векторів канаміцин опору ген являє маркер виділення бактерій. Шлюз, ccdB касети відображається між зелених стрілок, що представляють рекомбінації сайтів att R1 і att R2. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2: конструкція репортер мутагенезу
Малюнок 2: конструкція репортер мутагенезу. MTurquoise-eYFP репортер гени рухає promotor 35S CaMV. MTurquoise кодування регіону зливається з eYFP, кодування регіону перевозять CA мутації в нуклеотидної позиції 120, що призводить до передчасної зупинки трансляционная кодон TAA і дострокове припинення перекладу синтез білка. 3 'Nopaline синтетази (3' nos) сплайсингу сигнал використовується для завершення транскрипції конструкціі22. Сигнал ядерної локалізації (NLS) використовується для переведених білків в ядро. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: лоток заповнений Arabidopsis саджанців до і після лікування глюфосинату амонію
Малюнок 3: лоток заповнений Arabidopsis саджанців до і після лікування глюфосинату амонію. Саджанці, не виказуючи бар ген, який присутній в pBIBAC бар-GW T-ДНК вмирають після обприскують розчином глюфосинату амонію. Фотографії показують же лоток для розсади (A) перед розпиленням з глюфосинату амонію, через 14 днів після посіву і (B) 10 днів по тому, після розпорошується двічі. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4: стратегії обмеження загального ДНК для визначення числа і цілісності з вставлені T-Уну
Малюнок 4: стратегії обмеження загального ДНК для визначення числа і цілісності з вставлені T-Уну. (A) одне обмеження сайту (R) в середині T-ДНК дозволяє незалежним зондуючого зліва (червоний Л) і правою частиною T-ДНК (зелений R). Мультфільми про право показують, що в залежності від інтеграції з одне - або multi - копіювати T-ДНК, різних діапазонів візерунки виходять з промокальним ДНК. Смуг, відмічені * має певної довжини, в той час як тривалість інших груп залежить від найближчого сайту обмеження фланкіруя геномної ДНК. Однією вставки: L і R зонд обидва дають один незалежний фрагмент. Розмір очікуваних середньому фрагментів може розраховуватися на основі на частоті обмеження сайту в геномі. Мінімальний розмір - це відстань від місця обмеження на лівій межі (LB) або правій межі (РБ), в залежності від чого інтеграції є бути досліджений, і якщо Т-ДНК недоторканими. Тандемі повторити: Зонди для L і R дають обидва двох фрагментів; для кожного датчика, один з фрагментів включає флангові геномної ДНК другий фрагмент має очікуваний розмір і ідентифікується як зонди. Інвертований повторити: В залежності від спрямованості комплексної касету один L і два R фрагментів, або два L і один R можуть бути визначені. Окремих одного вставки: Результатом є число незалежних фрагментів, і кількість фрагментів відповідає числу впроваджень. (B) обмеження сайтів на кінцях T-ДНК дозволяє визначити цілісність фрагмента між місця обмеження. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 5: агарозному гелі з обмеженням шаблону і відповідності прозорості
Малюнок 5: агарозному гелі з обмеженням шаблону і відповідності прозорості. (A) на гелі агарози дна genomic перетравлюється з EcoR я показано. Правильне травлення ДНК свідчить наявність дискретних супутникової смуги. (B) Маркування позиції слотів і маркер смуг на прозорості робить можливим пізніше легко обчислити розмір гібридизувати фрагментів. Тут використовуються маркери MRC Голландії (синій і червоний), позначається м. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 6: Налаштування для капілярної blotting
Малюнок 6: Налаштування для капілярної blotting. У капіляр промокальним установки фільтрувальна папір поміщається на пластиковій пластині з кінця паперу, висить в 20 x SSC буфера. Папір зволожений з 20 x SSC і гелю агарози, розміщений на вершині, слідують мембрани нейлону, фільтрувальна папір і стек тканин. Легка вага знаходиться на вершині. Обережність для видалення бульбашок повітря між гель, папір і мембрани. Чіплятися плівки використовується щоб уникнути висихання установки. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 7: приклад ДНК промокальним стратегії і експериментальних результатів
Малюнок 7: приклад ДНК промокальним стратегії і експериментальних результатів. (A) ДНК промокальним стратегії для визначення числа і цілісності T-ДНК інтеграцій. Різка розташування обраного ензимів обмеження в T-ДНК вказані з вертикальною лінією. EYFP і бар датчики, які використовуються для гібридизації з перетравлюється геномної ДНК, вказані за допомогою рядка з терміналу точкою нижче T-ДНК. (D B -) Приклад ДНК помарок. Геномна ДНК був скорочений з Sca я і пляма було досліджено з бар і eYFP зонда (B і C). Геномна ДНК був вирізати з Bgl II і Pci я і досліджений з зондом бар. Недоторканими фрагменти є 5,5 kbp в розмір (D). Зверніть увагу, що набір зразків в D відрізняється від зазначених в B і C. * вказує розмір очікуваного фрагментів; М, маркер. В B, C і D використовується же розмір маркера. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 8: рівні вираження mTurquoise-eYFP і ODM ефективності лінії репортер незалежних mTurquoise-eYFP
Малюнок 8: рівні вираження mTurquoise-eYFP і ODM ефективності лінії репортер незалежних mTurquoise-eYFP. (A) відносна mTurquoise-eYFP Стенограма рівнях вимірюється RT-ПЛР в DM19 репортер ліній. Для нормалізації Стенограма рівні актину були використані. (B) ODM ефективність вимірюється в лініях репортер DM19. Для A і B, бари вказують в середньому не менше п'яти біологічних реплицирует. Планки похибок вказують SEM. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Тип T-ДНК Локус Кількість впроваджень T-ДНК Репортер лінія Кількість виявлених фрагментів Цілісність SCA Я BGL II BGL II / PciI Бар eYFP Бар eYFP eYFP Інтеграція в одному локусі 1 19 [2] -2 1 1 1 1 + 1 19 [2] -5 1 1 1 1 + 1 19 [2] -9 1 1 1 1 + 1 19 [2] -11 1 1 1 1 + 1 19 [4] -1 1 1 1 1 + 1 19 [4] -2 1 + 1 1 + 1 + 2, Перевернутий повторити 19 [2] -10 2 1 + 1 1 +2, неповної інтеграції 19 [2] -3 1 2 1 1 ND Кілька Локус інтеграцій 2 19 [2] -6 2 2 2 ND 2 19 [2] -7 2 ​​2 2 2 ND 3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND ND - не визначений.

Таблиця 1: Резюме промокальним даних для ізоляції після перетворення з pDM19 мутація ДНК.

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

За допомогою системи BIBAC-GW, репортер конструкції для вивчення ODM в рослинах були созданние10. Конструкції були розроблені в pENTR-gm вектора входу шлюза12 і вставляється в pBIBAC бар-GW (рис. 1) з використанням реакції рекомбінації шлюзу LR.

Арабідопсис були перетворені з pDM19, BIBAC-бар-GW плазмида з mTurquoise-eYFP репортер, що перевозять кодоном трансляционная стоп рамка eYFP читання в позиції 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (Малюнок 2) 10. В цілому 126 рослини арабідопсис були перетворюється (9 рослини в горщик, 14 горщики). Насіння цих рослин були об'єднані, посіяли на піддони з грунтом і дозволено рости за два тижні до початку лікування розчином глюфосинату амонію. Тільки саджанці, висловлюючи бар Джин (присутній в BIBAC-бар-GW) вижити глюфосинату амонію лікування (рис. 3). В цілому були визначені 11 мутація перетворена з pDM19, відповідно перетворенню ефективності 0,02% насіння проаналізовані.

Для 11 мутація ізольовані ДНК промокальним був використаний для визначення кількості Т-ДНК інтеграцій. Для цієї мети геномної ДНК був скорочений з Bgl II або Sca я (стратегія розроблена на малюнку 4A). Обидва цих ензимів обмеження тільки один раз розрізати на T-ДНК послідовності (рис. 7A). Гібридизації з зондами, визнаючи бар і eYFP, що кодують області допускається визначення числа відповідних фрагментів ДНК.

Кількість окремих ДНК фрагментів на помарки, допускається для оцінки кількості вставок T-ДНК в лінії репортер (Таблиця 1). Один гібридизувати фрагментів з бару і eYFP зонда вказано наявність єдиного інтеграції T-ДНК. Від 11 мутація проаналізовані шість здійснюється однією інтеграцій. Середня кількість впроваджень був 1.2.

Для 6 ліній, що перевозять один інтеграції T-ДНК цілісність конструкції вставленої репортер був випробуваний з використанням ДНК промокальним (стратегія розроблена на малюнку 4В). Геномна ДНК був скорочений з Bgl II і Pci я випустити 5,5 КБ фрагмент, що містить Джин фьюжн бар і mTurquoise-eYFP (рис. 7A). Зонд проти eYFP був використаний для визначення очікуваного фрагмент. Всі заводи випробування перевозяться фрагмент недоторканими. Зверніть увагу, що фрагмент вивчені виключає зліва і право T-ДНК кордону і тому не перевіряє цілісність всього T-ДНК, але тільки частина, яка містить трансгенів інтерес.

Експресії гена флуоресцентні репортер був визначений в незалежних поштучно трансгенних ліній тільки відрізняються геномної розташування T-ДНК. Відносне стенограми рівні репортер ініціативи промоутер mTurquoise-eYFP CaMV 35S були виміряні за RT-ПЛР в чотири лінії репортер DM19, що перевозять недоторканими, однієї копії інтеграцій, з яких геномні позиція була определени10. Зміни в рівнях вираження гена репортера між лініями був незначним: максимальна різниця в рівнях РНК mTurquoise-eYFP був в 2 рази (рис. 8A).

Далі в ці лінії репортер була проведена ODM. Три з чотирьох ліній незалежним репортером показали досить аналогічні ODM ефективності (Малюнок 8B). Однак, одна лінія, DM19 [4] 1, принесли досить низька ефективність ODM, в порівнянні з іншими лініями. Ці результати показують, що ODM залежить від місцевих геномної контексту. Яким чином місцеві геномної контексті інтеграції T-ДНК в DM19 [4] 1 відрізняється від інших ліній належить визначити. Аналіз доступних наборів знаків активних і неактивних хроматину в геномної місцях інтеграції T-ДНК в НЕ трансгенних рослин не представила ответ10.

Малюнок 1: функціональні карти pBIBAC-GW векторів
Малюнок 1: функціональні карти pBIBAC-GW векторів. pBIBAC-GW похідні доступні або опір до глюфосинату (бар) або DsRed флуоресценції в насіння пальто (DsRed) як маркер виділення в рослинах. Для обох векторів канаміцин опору ген являє маркер виділення бактерій. Шлюз, ccdB касети відображається між зелених стрілок, що представляють рекомбінації сайтів att R1 і att R2. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2: конструкція репортер мутагенезу
Малюнок 2: конструкція репортер мутагенезу. MTurquoise-eYFP репортер гени рухає promotor 35S CaMV. MTurquoise кодування регіону зливається з eYFP, кодування регіону перевозять CA мутації в нуклеотидної позиції 120, що призводить до передчасної зупинки трансляционная кодон TAA і дострокове припинення перекладу синтез білка. 3 'Nopaline синтетази (3' nos) сплайсингу сигнал використовується для завершення транскрипції конструкціі22. Сигнал ядерної локалізації (NLS) використовується для переведених білків в ядро. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: лоток заповнений Arabidopsis саджанців до і після лікування глюфосинату амонію
Малюнок 3: лоток заповнений Arabidopsis саджанців до і після лікування глюфосинату амонію. Саджанці, не виказуючи бар ген, який присутній в pBIBAC бар-GW T-ДНК вмирають після обприскують розчином глюфосинату амонію. Фотографії показують же лоток для розсади (A) перед розпиленням з глюфосинату амонію, через 14 днів після посіву і (B) 10 днів по тому, після розпорошується двічі. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4: стратегії обмеження загального ДНК для визначення числа і цілісності з вставлені T-Уну
Малюнок 4: стратегії обмеження загального ДНК для визначення числа і цілісності з вставлені T-Уну. (A) одне обмеження сайту (R) в середині T-ДНК дозволяє незалежним зондуючого зліва (червоний Л) і правою частиною T-ДНК (зелений R). Мультфільми про право показують, що в залежності від інтеграції з одне - або multi - копіювати T-ДНК, різних діапазонів візерунки виходять з промокальним ДНК. Смуг, відмічені * має певної довжини, в той час як тривалість інших груп залежить від найближчого сайту обмеження фланкіруя геномної ДНК. Однією вставки: L і R зонд обидва дають один незалежний фрагмент. Розмір очікуваних середньому фрагментів може розраховуватися на основі на частоті обмеження сайту в геномі. Мінімальний розмір - це відстань від місця обмеження на лівій межі (LB) або правій межі (РБ), в залежності від чого інтеграції є бути досліджений, і якщо Т-ДНК недоторканими. Тандемі повторити: Зонди для L і R дають обидва двох фрагментів; для кожного датчика, один з фрагментів включає флангові геномної ДНК другий фрагмент має очікуваний розмір і ідентифікується як зонди. Інвертований повторити: В залежності від спрямованості комплексної касету один L і два R фрагментів, або два L і один R можуть бути визначені. Окремих одного вставки: Результатом є число незалежних фрагментів, і кількість фрагментів відповідає числу впроваджень. (B) обмеження сайтів на кінцях T-ДНК дозволяє визначити цілісність фрагмента між місця обмеження. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 5: агарозному гелі з обмеженням шаблону і відповідності прозорості
Малюнок 5: агарозному гелі з обмеженням шаблону і відповідності прозорості. (A) на гелі агарози дна genomic перетравлюється з EcoR я показано. Правильне травлення ДНК свідчить наявність дискретних супутникової смуги. (B) Маркування позиції слотів і маркер смуг на прозорості робить можливим пізніше легко обчислити розмір гібридизувати фрагментів. Тут використовуються маркери MRC Голландії (синій і червоний), позначається м. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 6: Налаштування для капілярної blotting
Малюнок 6: Налаштування для капілярної blotting. У капіляр промокальним установки фільтрувальна папір поміщається на пластиковій пластині з кінця паперу, висить в 20 x SSC буфера. Папір зволожений з 20 x SSC і гелю агарози, розміщений на вершині, слідують мембрани нейлону, фільтрувальна папір і стек тканин. Легка вага знаходиться на вершині. Обережність для видалення бульбашок повітря між гель, папір і мембрани. Чіплятися плівки використовується щоб уникнути висихання установки. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 7: приклад ДНК промокальним стратегії і експериментальних результатів
Малюнок 7: приклад ДНК промокальним стратегії і експериментальних результатів. (A) ДНК промокальним стратегії для визначення числа і цілісності T-ДНК інтеграцій. Різка розташування обраного ензимів обмеження в T-ДНК вказані з вертикальною лінією. EYFP і бар датчики, які використовуються для гібридизації з перетравлюється геномної ДНК, вказані за допомогою рядка з терміналу точкою нижче T-ДНК. (D B -) Приклад ДНК помарок. Геномна ДНК був скорочений з Sca я і пляма було досліджено з бар і eYFP зонда (B і C). Геномна ДНК був вирізати з Bgl II і Pci я і досліджений з зондом бар. Недоторканими фрагменти є 5,5 kbp в розмір (D). Зверніть увагу, що набір зразків в D відрізняється від зазначених в B і C. * вказує розмір очікуваного фрагментів; М, маркер. В B, C і D використовується же розмір маркера. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 8: рівні вираження mTurquoise-eYFP і ODM ефективності лінії репортер незалежних mTurquoise-eYFP
Малюнок 8: рівні вираження mTurquoise-eYFP і ODM ефективності лінії репортер незалежних mTurquoise-eYFP. (A) відносна mTurquoise-eYFP Стенограма рівнях вимірюється RT-ПЛР в DM19 репортер ліній. Для нормалізації Стенограма рівні актину були використані. (B) ODM ефективність вимірюється в лініях репортер DM19. Для A і B, бари вказують в середньому не менше п'яти біологічних реплицирует. Планки похибок вказують SEM. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Тип T-ДНК Локус Кількість впроваджень T-ДНК Репортер лінія Кількість виявлених фрагментів Цілісність SCA Я BGL II BGL II / PciI Бар eYFP Бар eYFP eYFP Інтеграція в одному локусі 1 19 [2] -2 1 1 1 1 + 1 19 [2] -5 1 1 1 1 + 1 19 [2] -9 1 1 1 1 + 1 19 [2] -11 1 1 1 1 + 1 19 [4] -1 1 1 1 1 + 1 19 [4] -2 1 + 1 1 + 1 + 2, Перевернутий повторити 19 [2] -10 2 1 + 1 1 +2, неповної інтеграції 19 [2] -3 1 2 1 1 ND Кілька Локус інтеграцій 2 19 [2] -6 2 2 2 ND 2 19 [2] -7 2 ​​2 2 2 ND 3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND ND - не визначений.

Таблиця 1: Резюме промокальним даних для ізоляції після перетворення з pDM19 мутація ДНК.

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

За допомогою системи BIBAC-GW, репортер конструкції для вивчення ODM в рослинах були созданние10. Конструкції були розроблені в pENTR-gm вектора входу шлюза12 і вставляється в pBIBAC бар-GW (рис. 1) з використанням реакції рекомбінації шлюзу LR.

Арабідопсис були перетворені з pDM19, BIBAC-бар-GW плазмида з mTurquoise-eYFP репортер, що перевозять кодоном трансляционная стоп рамка eYFP читання в позиції 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (Малюнок 2) 10. В цілому 126 рослини арабідопсис були перетворюється (9 рослини в горщик, 14 горщики). Насіння цих рослин були об'єднані, посіяли на піддони з грунтом і дозволено рости за два тижні до початку лікування розчином глюфосинату амонію. Тільки саджанці, висловлюючи бар Джин (присутній в BIBAC-бар-GW) вижити глюфосинату амонію лікування (рис. 3). В цілому були визначені 11 мутація перетворена з pDM19, відповідно перетворенню ефективності 0,02% насіння проаналізовані.

Для 11 мутація ізольовані ДНК промокальним був використаний для визначення кількості Т-ДНК інтеграцій. Для цієї мети геномної ДНК був скорочений з Bgl II або Sca я (стратегія розроблена на малюнку 4A). Обидва цих ензимів обмеження тільки один раз розрізати на T-ДНК послідовності (рис. 7A). Гібридизації з зондами, визнаючи бар і eYFP, що кодують області допускається визначення числа відповідних фрагментів ДНК.

Кількість окремих ДНК фрагментів на помарки, допускається для оцінки кількості вставок T-ДНК в лінії репортер (Таблиця 1). Один гібридизувати фрагментів з бару і eYFP зонда вказано наявність єдиного інтеграції T-ДНК. Від 11 мутація проаналізовані шість здійснюється однією інтеграцій. Середня кількість впроваджень був 1.2.

Для 6 ліній, що перевозять один інтеграції T-ДНК цілісність конструкції вставленої репортер був випробуваний з використанням ДНК промокальним (стратегія розроблена на малюнку 4В). Геномна ДНК був скорочений з Bgl II і Pci я випустити 5,5 КБ фрагмент, що містить Джин фьюжн бар і mTurquoise-eYFP (рис. 7A). Зонд проти eYFP був використаний для визначення очікуваного фрагмент. Всі заводи випробування перевозяться фрагмент недоторканими. Зверніть увагу, що фрагмент вивчені виключає зліва і право T-ДНК кордону і тому не перевіряє цілісність всього T-ДНК, але тільки частина, яка містить трансгенів інтерес.

Експресії гена флуоресцентні репортер був визначений в незалежних поштучно трансгенних ліній тільки відрізняються геномної розташування T-ДНК. Відносне стенограми рівні репортер ініціативи промоутер mTurquoise-eYFP CaMV 35S були виміряні за RT-ПЛР в чотири лінії репортер DM19, що перевозять недоторканими, однієї копії інтеграцій, з яких геномні позиція була определени10. Зміни в рівнях вираження гена репортера між лініями був незначним: максимальна різниця в рівнях РНК mTurquoise-eYFP був в 2 рази (рис. 8A).

Далі в ці лінії репортер була проведена ODM. Три з чотирьох ліній незалежним репортером показали досить аналогічні ODM ефективності (Малюнок 8B). Однак, одна лінія, DM19 [4] 1, принесли досить низька ефективність ODM, в порівнянні з іншими лініями. Ці результати показують, що ODM залежить від місцевих геномної контексту. Яким чином місцеві геномної контексті інтеграції T-ДНК в DM19 [4] 1 відрізняється від інших ліній належить визначити. Аналіз доступних наборів знаків активних і неактивних хроматину в геномної місцях інтеграції T-ДНК в НЕ трансгенних рослин не представила ответ10.

Малюнок 1: функціональні карти pBIBAC-GW векторів
Малюнок 1: функціональні карти pBIBAC-GW векторів. pBIBAC-GW похідні доступні або опір до глюфосинату (бар) або DsRed флуоресценції в насіння пальто (DsRed) як маркер виділення в рослинах. Для обох векторів канаміцин опору ген являє маркер виділення бактерій. Шлюз, ccdB касети відображається між зелених стрілок, що представляють рекомбінації сайтів att R1 і att R2. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2: конструкція репортер мутагенезу
Малюнок 2: конструкція репортер мутагенезу. MTurquoise-eYFP репортер гени рухає promotor 35S CaMV. MTurquoise кодування регіону зливається з eYFP, кодування регіону перевозять CA мутації в нуклеотидної позиції 120, що призводить до передчасної зупинки трансляционная кодон TAA і дострокове припинення перекладу синтез білка. 3 'Nopaline синтетази (3' nos) сплайсингу сигнал використовується для завершення транскрипції конструкціі22. Сигнал ядерної локалізації (NLS) використовується для переведених білків в ядро. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: лоток заповнений Arabidopsis саджанців до і після лікування глюфосинату амонію
Малюнок 3: лоток заповнений Arabidopsis саджанців до і після лікування глюфосинату амонію. Саджанці, не виказуючи бар ген, який присутній в pBIBAC бар-GW T-ДНК вмирають після обприскують розчином глюфосинату амонію. Фотографії показують же лоток для розсади (A) перед розпиленням з глюфосинату амонію, через 14 днів після посіву і (B) 10 днів по тому, після розпорошується двічі. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4: стратегії обмеження загального ДНК для визначення числа і цілісності з вставлені T-Уну
Малюнок 4: стратегії обмеження загального ДНК для визначення числа і цілісності з вставлені T-Уну. (A) одне обмеження сайту (R) в середині T-ДНК дозволяє незалежним зондуючого зліва (червоний Л) і правою частиною T-ДНК (зелений R). Мультфільми про право показують, що в залежності від інтеграції з одне - або multi - копіювати T-ДНК, різних діапазонів візерунки виходять з промокальним ДНК. Смуг, відмічені * має певної довжини, в той час як тривалість інших груп залежить від найближчого сайту обмеження фланкіруя геномної ДНК. Однією вставки: L і R зонд обидва дають один незалежний фрагмент. Розмір очікуваних середньому фрагментів може розраховуватися на основі на частоті обмеження сайту в геномі. Мінімальний розмір - це відстань від місця обмеження на лівій межі (LB) або правій межі (РБ), в залежності від чого інтеграції є бути досліджений, і якщо Т-ДНК недоторканими. Тандемі повторити: Зонди для L і R дають обидва двох фрагментів; для кожного датчика, один з фрагментів включає флангові геномної ДНК другий фрагмент має очікуваний розмір і ідентифікується як зонди. Інвертований повторити: В залежності від спрямованості комплексної касету один L і два R фрагментів, або два L і один R можуть бути визначені. Окремих одного вставки: Результатом є число незалежних фрагментів, і кількість фрагментів відповідає числу впроваджень. (B) обмеження сайтів на кінцях T-ДНК дозволяє визначити цілісність фрагмента між місця обмеження. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 5: агарозному гелі з обмеженням шаблону і відповідності прозорості
Малюнок 5: агарозному гелі з обмеженням шаблону і відповідності прозорості. (A) на гелі агарози дна genomic перетравлюється з EcoR я показано. Правильне травлення ДНК свідчить наявність дискретних супутникової смуги. (B) Маркування позиції слотів і маркер смуг на прозорості робить можливим пізніше легко обчислити розмір гібридизувати фрагментів. Тут використовуються маркери MRC Голландії (синій і червоний), позначається м. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 6: Налаштування для капілярної blotting
Малюнок 6: Налаштування для капілярної blotting. У капіляр промокальним установки фільтрувальна папір поміщається на пластиковій пластині з кінця паперу, висить в 20 x SSC буфера. Папір зволожений з 20 x SSC і гелю агарози, розміщений на вершині, слідують мембрани нейлону, фільтрувальна папір і стек тканин. Легка вага знаходиться на вершині. Обережність для видалення бульбашок повітря між гель, папір і мембрани. Чіплятися плівки використовується щоб уникнути висихання установки. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 7: приклад ДНК промокальним стратегії і експериментальних результатів
Малюнок 7: приклад ДНК промокальним стратегії і експериментальних результатів. (A) ДНК промокальним стратегії для визначення числа і цілісності T-ДНК інтеграцій. Різка розташування обраного ензимів обмеження в T-ДНК вказані з вертикальною лінією. EYFP і бар датчики, які використовуються для гібридизації з перетравлюється геномної ДНК, вказані за допомогою рядка з терміналу точкою нижче T-ДНК. (D B -) Приклад ДНК помарок. Геномна ДНК був скорочений з Sca я і пляма було досліджено з бар і eYFP зонда (B і C). Геномна ДНК був вирізати з Bgl II і Pci я і досліджений з зондом бар. Недоторканими фрагменти є 5,5 kbp в розмір (D). Зверніть увагу, що набір зразків в D відрізняється від зазначених в B і C. * вказує розмір очікуваного фрагментів; М, маркер. В B, C і D використовується же розмір маркера. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 8: рівні вираження mTurquoise-eYFP і ODM ефективності лінії репортер незалежних mTurquoise-eYFP
Малюнок 8: рівні вираження mTurquoise-eYFP і ODM ефективності лінії репортер незалежних mTurquoise-eYFP. (A) відносна mTurquoise-eYFP Стенограма рівнях вимірюється RT-ПЛР в DM19 репортер ліній. Для нормалізації Стенограма рівні актину були використані. (B) ODM ефективність вимірюється в лініях репортер DM19. Для A і B, бари вказують в середньому не менше п'яти біологічних реплицирует. Планки похибок вказують SEM. будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Тип T-ДНК Локус Кількість впроваджень T-ДНК Репортер лінія Кількість виявлених фрагментів Цілісність SCA Я BGL II BGL II / PciI Бар eYFP Бар eYFP eYFP Інтеграція в одному локусі 1 19 [2] -2 1 1 1 1 + 1 19 [2] -5 1 1 1 1 + 1 19 [2] -9 1 1 1 1 + 1 19 [2] -11 1 1 1 1 + 1 19 [4] -1 1 1 1 1 + 1 19 [4] -2 1 + 1 1 + 1 + 2, Перевернутий повторити 19 [2] -10 2 1 + 1 1 +2, неповної інтеграції 19 [2] -3 1 2 1 1 ND Кілька Локус інтеграцій 2 19 [2] -6 2 2 2 ND 2 19 [2] -7 2 ​​2 2 2 ND 3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND ND - не визначений.

Таблиця 1: Резюме промокальним даних для ізоляції після перетворення з pDM19 мутація ДНК.

Категории
  • Биология
  • Математика
  • Краеведению
  • Лечебная
  • Наука
  • Физике
  • Природоведение
  • Информатика
  • Новости

  • Новости
    Подготовка к ЕГЭ по математике
    Статьи Опубликовано: 05.10.2017 Подготовка к ЕГЭ по МАТЕМАТИКЕ. 1 часть. Эффективный курс подготовки. Вы находитесь на сайте www.ege-ok.ru - Подготовка к ЕГЭ по математике. Меня зовут Инна Владимировна

    Куда поступить с обществознанием, русским и математикой
    Статьи Опубликовано: 06.10.2017 Сдача ЕГЭ. Куда поступать? Обществознание считается одним из самых популярных предметов, которые выпускники сдают на ЕГЭ. Ввиду высокого рейтинга дисциплины Рособрнадзор

    Сайт Майер Елены - ЕГЭ по математике
    Планируется проведение двух отдельных экзаменов – базового и профильного. Кому сдавать базовый ЕГЭ по математике? Базовый ЕГЭ организуется для выпускников, изучающих математику для общего развития

    ГДЗ решебник по математике 4 класс
    Извините, тут пока ничего нет ((( Решебник по математике 4 класс (Истомина Н.Б.) – не просто возможность быстро выполнить домашнее задание для учащегося, но и способ разобраться в труднорешаемых задачах.

    ГДЗ по математике 1 класс Самсонова самостоятельные работы
    Решебник по математике за 1 класс автора Самсоновой Л.Ю. 2012 года издания. Данное пособие предлагает готовые решения на разнообразные упражнения, направленные на активизацию всего учебного процесса. Здесь

    Для этой работы нужна математика
    Слотов: 956 Рулеток: 7 Лицензия: Pragmatic Play, Microgaming, ELK, Yggdrasil, Habanero, Amatic, Isoftbet, Netent, Rival, Igrosoft, Quickspin. Игры: Автоматы, Покер, Рулетки. Всего 963 Отдача: 98% Бонус

    Веселые задачи по математике 2 класс
    Во время занятий для того, чтобы немного переключить внимание школьников, но при этом не уйти от предмета, можно давать шутливые задачи на сообразительность. Буду пополнять коллекцию таких задач. Дополнительная

    Функция экспонента в Excel
    Одной из самых известных показательных функций в математике является экспонента. Она представляет собой число Эйлера, возведенное в указанную степень. В Экселе существует отдельный оператор, позволяющий

    ЕГЭ по математике 2018
    ЕГЭ по математике, наравне с русским языком , – обязательный экзамен для сдачи выпускниками 11-х классов. По статистике он самый сложный. Мы предлагаем ознакомиться с общей информацией об экзамене и

    Секреты эффективной и быстрой подготовки ко второй части ОГЭ по математике.
    Уважаемые девятиклассники, настоящие или будущие! Часто от вас приходится слышать следующие вопросы. Легко ли подготовиться к заданиям второй части ОГЭ по математике? Сколько для этого понадобится


    Наши клиенты
    Клиенты

    Быстрая связь

    Тел.: (044) 587-84-78
    E-mail: [email protected]

    Имя:
    E-mail:
    Телефон:
    Вопрос\Комментарий: